Nat. Commun | 结合二维深度神经网络和迁移学习 预测RNA二级结构

研究背景

RNA分子是生物体内参与各种如细胞分化、代谢、记忆存储等重要生命活动的一类大分子，其常见的种类有rRNA、mRNA、tRNA。近年来越来越多的实验表明RNA似乎无处不在、无所不能，而事实上，编码用的mRNA才占1.5%，而非编码RNA则占据了人类基因组的75％。但是我们对绝大多数的非编码RNA了解甚少，主要原因是缺乏结构信息，因为结构决定功能，不知道结构，我们就无法推测其功能。

RNA的三维结构往往是在先形成的二级结构的框架上堆叠而成的，所以知道二级结构对于RNA结构建模和理解其功能机制至关重要。二级结构是指RNA序列各个位置有氢健互补配对的碱基（例如第i个碱基与第j个碱基（i:j）有氢健相连），而邻近不间断多个配对碱基的堆积（i:j ，i-1:j+1，i-2:j+2等）所形成的螺旋长茎区是二级结构稳定的关键。如下图所示，二级结构的二维描述是螺旋茎区加无碱基配对的各种环状结构（Hairpin Loop发夹环；Multiple Loop多环；Internal Loop内环；Bulge Loop凸环），它也可以通过一维的碱基连接图来显示。

虽然二级结构是关于碱基的配对，但碱基的配对不仅仅有二级结构的信息。RNA序列通常是由四个碱基（A，C，G，U）的排列组合所组成。在两个碱基配对里，AU和GC配对最稳定、被称为Watson-Crick配对，GU是次稳定的配对（Wobble base pair）。其它碱基之间也能配对，它们被称为非规范碱基对，往往需要靠三维结构才能稳定下来。需要三维结构来稳定的还有孤碱基对（没有多个配对碱基的堆积）以及各种假结结构（Pseudoknot）（例如，一个茎环结构的茎的一半插入了另一个茎环结构的茎结构，相吻发卡（kissing hairpin），发卡-突环接触等，图二）。所以，完整的RNA碱基配对信息只有通过昂贵而且费时的三维结构测定才能精确获得。

但是最近十多年来，预测二级结构的精度一直在一个水平上徘徊不前(50%的覆盖率，75-83%的精确度)，这主要是下列原因：1）目前几乎所有的方法是基于折叠的算法（folding algorithm），需要一个能量函数来寻找最低自由能的状态，但目前的能量函数过于简单，无法描述复杂的RNA相互作用，2）大多数二级结构预测只关心长螺旋茎区的规范碱基对（AU，GC，和GU），而不考虑孤碱基对和非规范碱基对，这无疑会对寻找最低自由能带来不利的影响，3）没有什么好的方法来获得假结，因为假结对环境非常敏感。

与RNA二级结构预测对应的是蛋白质氨基酸残基间的接触图预测（contact map prediction）。最近几年来，通过深度学习，蛋白质二级结构和接触图预测的精确度有了极大的改善，并且提出了Raptor-X和SPOT-Contact等方法。本文受这些方法的启发，提出了一种可以用于预测RNA二级结构的深度学习模型—SPOT-RNA。该方法在预测假节、孤碱基对、和非规范碱基对（需要三维结构稳定的碱基对）上的改进更大。这个结果表明，用折叠算法来预测RNA二级结构的精确度上限可以用折叠以外的方法（深度学习+迁移学习）来打破。

方法介绍与结果展示

SPOT-RNA主要包括两个部分：（1）初始训练，通过从bpRNA （具有超过100,000个自动注释二级结构的RNA序列的大型数据库）构建非冗余RNA序列集来训练ResNets和LSTM模型（2）迁移学习，将第一步训练后的模型迁移到另一个高分辨率非冗余RNA序列数据集进行进一步训练和预测。

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初始训练（Initial training by bpRNA）

初始训练是使用包含13,419个RNA的数据集，进一步随机分成三部分，10,814个RNA作为训练集（TR0），1300个RNA作为验证集（VL0）和1,305个RNA作为测试集（TS0）。将数据以ont-hot形式输入，训练了多个参数不同的深度学习模型，并挑选和集成了在VL0上表现最好的五个模型，结果如下表所示。模型在验证集和测试集上的MCC相差不大，验证了模型良好的鲁棒性。

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迁移学习（Transfer learning with RNA structures）

将初始训练得到的模型转移到高分辨率非冗余的新数据集上，新数据集的训练集（TR1）、验证集（VL1）以及测试集（TS1）分别为120、30和67个RNA，并且使用CD-HIT-EST和BLAST-N对数据进行了进一步处理来消除序列同源性。如下图所示，迁移学习的各项指标都全面超过初始训练和直接训练，验证了迁移学习的有效性。

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RNA二级结构预测方法的比较

如下图所示，a展示了集成迁移模型和其他十二种方法在TS1上的召回率曲线，b展示了各种方法在单个RNA上F1值的分布情况，方框的中心和上下边框分别表示中位数、75百分位数和25百分位数，离群点（outliers）用“+”来表示。

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去除非规范碱基对后模型性能比较

上述比较实验对于SPOT-RNA来说比较有优势，因为几乎所有的其他方法都只能对标准碱基对进行预测，其中也包括Watson-Crick碱基对和Wobble碱基对。所以为了证明SPOT-RNA的有效性，本文将数据集中的非规范碱基对剔除后再一次进行了实验对比，实验结果表示SPOT-RNA仍然具有最佳的表现，相比于第二名至少有6%的效果提升，结果如下图所示：

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与假节关联的碱基对预测问题

与假节关联的碱基对一直是个十分具有挑战性的问题，因为他们往往与难以预测的三级相互作用相关。为了能够进行更加直观的比较，论文将假结对定义为移除后便成为无假结二级结构的最小碱基对数。下图给出了各种方法的实验效果对比，尽管所有模型在假节上的效果都表现不佳，但SPOT-RNA的F1得分相比于第二名仍然提高了52%。

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在不同基元的二级结构上的性能比较

RNA的二级结构根据不同的基元具有不同的结构类型，使用bqRNA对每一个二级结构根据基元来分类就能得到不同的类别，针对这些类别分别进行实验，虽然在某些类别上的F1得分略低于其他方法，但是在大多数类别上均优于其他方法。

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在TS2上的性能比较

为了进一步验证模型性能，使用NMR构建了另一个包含39个RNA二级结构的测试集TS2，与TS1相同，TS2也使用CD-HIT-EST和BLAST-N消除了冗余性。下图a展示了SPOT-RNA以及其他方法在TS2上的精度-召回率曲线，SPOT-RNA的表现仍然最佳。此外，下图b展示了F1评分在中位数、25百分位和75百分位数上的分布。SPOT-RNA以最小波动率达到最高的中位F1评分。但在此处没有对假节预测的效果进行比较，原因是TS2的假节中碱基对数量太少（仅有21对），无法进行有说服力的实验。

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在最新的6个RNA上的性能比较

作者还收集了近期刚得知其二级结构的6个RNA，并在其上进行了对比实验，实验结果如下，除了d和f以外，SPOT-RNA的F1得分均高于其他方法。

结论

本文提出了一个基于RNA序列来预测其二级结构的深度学习模型—SPOT-RNA，该方法的主要优点是可以对所有的碱基对进行训练和预测，而相比之下，基于折叠的方法则必须有精确的能量参数来捕获非正则碱基对，并且需要复杂的算法来进行全局最小搜索来对假节点配对进行解释。作者还在多个数据集上用不同的评价指标分别进行了对比实验，证明了SPOT-RNA的鲁棒性和有效性。

参考资料

论文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-019-13395-9

bpRNA数据链接

https://github.com/hendrixlab/bpRNA

数据和在线服务器

http://sparks-lab.org/jaswinder/server/SPOT-RNA/

数据及其源码

https://github.com/jaswindersingh2/SPOT-RNA