CNV简介和分析工具

CNV的全称是Copy number variation ，是指在不同的人的基因组上出现的大片段的拷贝数增加或缺失，一般是5kb 以上的片段。

在人类的染色体上，各个基因是线性的形式排列在染色体上， 比如说正常的一个染色体包含了A-B-C-D-E-F 这几个基因，如果D基因发生了拷贝数增加。

那么该染色体的形式就是A-B-C-D-D-E-F了，这种情况在肿瘤病人的基因组中比较常见。因为肿瘤细胞的基因组是很不稳定的，在细胞分裂，染色体复制的时候容易出错，就会产生拷贝数变异。

对于NGS（Next generation sequencing）产生的数据，可以通过序列比对，然后根据不同基因所在区域的测序深度估计CNV是否存在。

目前对于基因组的测序，都是通过打断后，进行扩增或杂交，再进行建库进行测序的，发生拷贝数变异的区域，测得的深度会与正常的区域有比较明显的区别。

比对的原理如下：

将短片段的reads 回贴到参考基因组上， 确定它们的位置，产生BAM文件（reads的堆叠信息）或者pileup文件（碱基的堆叠信息）

可视化BAM文件，采用BamView （http://sanger-pathogens.github.io/Artemis/BamView/ ）   或者IGV，效果如图：

注： 该图显示的是测序数据在hg19  chr17： 7571200 - 7580800 之间的reads堆叠信息，蓝色横线即为reads（“chr17" 未在图中展示）

目前检测CNV的软件有很多，比较常见的是CNVnator或cnvkit， 当然最新版本的GATK( Genome Analysis ToolKit ) 也已经能够检测CNV了。

参考： Whole-genome CNV analysis: advances in computational approaches 这篇文献

在基因组上，不同区域比对上的reads是不一样的，所以测序深度不一样，可以据此绘制测序深度图，由于某些实验方法，GC含量高的区域更容易捕获到更多DNA片段，产生的reads更多，所以需要对GC含量高的基因组区域进行一定的矫正。

以下展示的是未矫正的Reads比对信息产生的测序深度（图片上方的曲线）示意图：

对于CNV的分析一般是从bam文件开始，以下是采用samtools 截取某些区域产生更小的BAM的方法：

 samtools view -h test_A.bam chr17:7572800-7600000 > test.sam
 samtools view -bS test.sam | samtools sort - -o test.bam
 samtools index test.bam

以下是对某些区域的测序深度作图的方法

samtools depth -r chr10:123237000-123360000 -d 10000000 -a test_A.bam > results.cov
 
samtools depth -r chr17:7572800-7600000 -d 10000000 -a test_A.bam > results_1.cov


## 采用以下R脚本

#!/usr/bin/env Rscript
 
opts <- commandArgs(TRUE)
 
dep.data <- read.table(opts[1] , header=FALSE, sep="\t", na.strings="NA", strip.white=T
RUE)
colnames(dep.data) <- c("Chr", "locus", "depth" )
 
library(lattice, pos = 0)
 
pdf("res_1.pdf", width= 20, height = 8) 
xyplot(depth ~ locus, type="p", pch=16, auto.key=list(border=TRUE), par.settings=simple
Theme(pch=16), scales=list(x=list(relation='same'), y=list(relation='same')), data=dep.
data, main="depth by locus - Chr10 (Test_Sample)")
 
dev.off()

## R脚本使用方法

Rscript test.R results.cov

作图结果如下：

另外一个作图工具 ngsplot

https://github.com/shenlab-sinai/ngsplot

附录（samtools安装方法和CoNIFER使用说明）

查看系统版本信息

cat /etc/lsb-release
 
DISTRIB_ID=Ubuntu
DISTRIB_RELEASE=18.04
DISTRIB_CODENAME=bionic
DISTRIB_DESCRIPTION="Ubuntu 18.04 LTS"

安装samtools等

apt-get install samtools
 
 
pip2 install numpy
pip2 install tables
pip2 install pysam
pip2 install matplotlib

查看python版本信息

python –version
Python 2.7.15rc1

CoNIFER是一个检测外显子数据CNV的工具，采用的是奇异值分解的方法，该分析工具依赖于以上的PyTable, Numpy, Matplotlib, Pysam这些python包。

主要有以下几步：

1. 创建bed 

2. 计算RPKM （输入数据是bed和bam文件）

3. 进行CNV的分析和作图

参考 http://conifer.sourceforge.net/tutorial.html